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PARP1和DNA拓扑异构酶II抑制活性测定

发布时间:2024-11-28 分享到:
    多聚(ADP-核糖)聚合酶1(Poly(ADP-ribose) polymerase 1, PARP1)在DNA修复和转录调控中起重要作用。PARP1抑制剂通过阻断PARP1的活性,干扰DNA修复过程,从而诱导癌细胞死亡,是治疗癌症的一种有效策略。特别是,PARP1抑制剂与DNA损伤剂联合使用,对携带BRCA1/2突变的癌症患者具有显著疗效。目前,已经开发了多种PARP1抑制剂,其中奥拉帕尼(Olaparib)已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗某些BRCA突变的晚期卵巢癌。然而,大多数合成PARP1抑制剂存在对PARP家族其他成员的高亲和力问题,限制了其特异性。因此,寻找新型、高效的PARP1抑制剂成为研究热点。

“Castalagin and vescalagin purified from leaves of Syzygium samarangense

(Blume) Merrill & L.M. Perry: Dual inhibitory activity against PARP1 and

DNA topoisomerase II”研究了从锡兰肉桂(Syzygium samarangense)叶中提取的两种天然化合物——vescalagin和castalagin对多聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)和DNA拓扑异构酶II(Top2)的抑制活性。


PARP1.png

 

实验方法

1. PARP1抑制活性筛选: 为了筛选具有PARP1抑制活性的天然化合物,研究团队从冲绳地区采集了多种亚热带和热带植物的叶、果和根,并使用加速溶剂萃取法提取了这些植物的化学成分。随后,通过PARP1抑制活性测定,评估了162种植物提取物的PARP1抑制率。测定方法基于PARP1催化NAD+生成聚(ADP-核糖)(PAR)的过程,通过检测反应后剩余的NAD+量来间接反映PARP1的活性。结果显示,锡兰肉桂叶提取物表现出最高的PARP1抑制活性(72.1%),因此被选为进一步纯化的起始材料。
2. 化合物纯化与鉴定从锡兰肉桂叶中提取的化合物通过反相高效液相色谱(HPLC)和凝胶过滤色谱进行纯化。在纯化过程中,通过PARP1抑制活性测定跟踪目标化合物的分离情况。最终,从HPLC的两个主要活性峰中分别纯化得到了两种化合物,并通过核磁共振(NMR)光谱、质谱(MS)和旋光度测定等手段鉴定为vescalagin(AQ1)和castalagin(AQ2),它们是已知的从其他植物中分离得到的ellagitannin类化合物。
3. PARP1和DNA拓扑异构酶II抑制活性测定: 为了定量评估vescalagin和castalagin对PARP1的抑制活性,研究团队测定了这两种化合物在不同浓度下的PARP1抑制率,并计算了它们的半抑制浓度(IC50)。此外,为了验证这两种化合物是否具有Top2抑制活性,研究团队使用了Topogen品牌的人重组DNA拓扑异构酶II货号TG200H-I)和DNA拓扑异构酶II药物筛选试剂盒(货号TG1009)进行了DNA拓扑异构酶II抑制活性测定。该测定通过观察超螺旋质粒DNA在DNA拓扑异构酶II存在下被转化为拓扑异构体的程度来评估DNA拓扑异构酶II的活性,从而间接反映化合物的Top2抑制活性。

货号

TG200H

TG1009

名称

Human Topoisomerase IIα Enzyme

人DNA拓扑异构酶IIα

Topoisomerase II Drug Screening Kit DNA拓扑异构酶药物筛选试剂盒

说明

纯化后的酶完全没有污染和核酸酶。它在两个步骤中改变了一个独特的拓扑异构体的连接数,SDS-PAGE上检测到的主要多肽为170 kDa。

这是一个基于DNA断裂的检测试剂盒,可以揭示特定药物是否拮抗拓扑异构酶II的作用,或者影响DNA的断裂/连接循环。

 

4. 细胞实验为了评估vescalagin和castalagin在细胞水平上对PARylation(PARP1的催化产物)的抑制作用,研究团队使用了人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系。细胞经不同浓度的vescalagin和castalagin处理后,通过Western blotting检测细胞内PARylated蛋白的水平。


实验结果

1. PARP1抑制活性:在PARP1抑制活性筛选中,锡兰肉桂叶提取物表现出最高的抑制活性(72.1%)。通过进一步的纯化步骤,成功从锡兰肉桂叶中提取并鉴定了两种具有PARP1抑制活性的化合物——vescalagin和castalagin。它们的IC50值分别为2.67μM和0.86μM,表明castalagin具有更强的PARP1抑制活性。
2. DNA拓扑异构酶II抑制活性在DNA拓扑异构酶II抑制活性测定中,vescalagin和castalagin均表现出对DNA拓扑异构酶II的抑制活性。具体而言,在较低浓度下(0.1-3μM),这两种化合物均能抑制DNA拓扑异构酶I依赖的超螺旋DNA向拓扑异构体的转化。这一结果表明,vescalagin和castalagin不仅具有PARP1抑制活性,还具有DNA拓扑异构酶I抑制活性,是一种潜在的双重抑制剂。
3. 细胞实验结果:细胞实验结果显示,vescalagin和castalagin在微摩尔浓度下能够显著抑制SH-SY5Y细胞内的PARylation过程。与未经处理的细胞相比,经过vescalagin或castalagin处理的细胞内PARylated蛋白水平明显降低。这一发现进一步证实了这两种化合物在细胞水平上对PARP1的抑制活性。
本研究从锡兰肉桂叶中成功提取并纯化了两种具有PARP1和Top2双重抑制活性的天然化合物——vescalagin和castalagin。这两种化合物在体外和细胞水平均表现出显著的PARP1抑制活性,并且vescalagin的抑制活性强于castalagin。此外,它们还具有Top2抑制活性,表明它们可能作为一种潜在的双重抑制剂用于癌症治疗。这一发现不仅丰富了PARP1抑制剂的种类和结构类型,也为癌症治疗提供了新的药物候选物。


针对PARP1筛选试剂盒,可推荐小分子药物研究专家BPS Bioscience的PARP1抑制剂筛选试剂盒:


货号

80580

80551

名称

PARP1 Colorimetric Assay Kit

PARP1 比色法检测试剂盒

PARP1 Chemiluminescent Assay Kit

PARP1 化学发光法检测试剂盒

说明

旨在测量PARP1活性,用于筛选抑制剂和分析应用。